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迪拜世博会丨大咖解读下一代分子诊断技术:CRISPR/Cas系统

理想的病原体核酸检测方式应该是准确、灵敏、快速、廉价、便携,并且能在各种环境下对任何病原体进行检测。

2022-04-08
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导语

理想的病原体核酸检测方式应该是准确、灵敏、快速、廉价、便携,并且能在各种环境下对任何病原体进行检测。近年来,基于成簇间隔的短回文重复序列及其关联蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins, CRISPR/Cas)的新型分子诊断工具,似乎具有成为这样理想化核酸检测平台的潜力。

01
下一代分子诊断技术!

从1987年首次发现CRISPR, 到最近几年CRISPR-associated(Cas)技术的广泛应用,以及2020年的诺贝尔化学奖颁给了CRISPR的发现者,CRISPR技术被誉为会改变和造福人类的发明。短短几年时间,CRISPR技术成为科研界的热门内容,被称为下一代分子诊断技术!

2020诺贝尔化学奖得主:

Emmanuelle Charpentier教授、Jennifer Doudna教授


而关于CRISPR技术在临床领域及新冠检测方面的应用,也成为了近期的讨论热点。中国科学院赵国屏院士、复旦大学附属中山医院胡必杰主任在2020迪拜世博会中国馆上海日《走近伯杰, 了解新冠抗疫中国方案、中国速度》专题直播中,围绕着新冠核酸快速检测技术,带来了关于CRISPR技术干货满满的分享与讨论。

02
从新冠核酸检测说开去

在专题讲座《速度为先 | 新冠核酸快速检测技术的应用及展望》中,胡必杰教授提出对于现在新型冠状病毒,国家提到了快速检测,上海市自10月28日起,全市首批21家二级以上综合性医疗机构面向市民提供24小时核酸检测服务,争取6小时出报告,对于现在新冠快速核酸检测技术,与赵院士一起探讨了值得期待和进一步开发的技术和应用。

赵国屏院士以新冠为例,讲到对于一个“好的”临床检验产品,有5个关键要求:


第一,就是要正确,不能“错怪好人”,不能出现“假阳性;必须准确,不能“张冠李戴”,专一性、特异性要好。第二一定要灵敏,也就是说不能“放过坏人”,不能出现假阴性。第三最好能够“定量”。定量是确定检测结果准确与否的重要佐证。第四,要快速,简便;第五成本要尽可能低


胡必杰教授表示,赵院士提到的“不抓错好人”、“不放过坏人”,同时定量,让临床医生更加精准地去辨别是感染的病原体还是污染的病原体,同时简捷方便与价优,是非常重要的。如果一项分子诊断技术非常昂贵,很多病人享受不到,只有达到以上五点要求,这项技术才能广泛应用到临床,最终让老百姓和普通病人得益。

03

等温扩增与CRISPR诊断技术

的有机结合


而后赵院士提到,在过去几十年的时间里,等温扩增技术得到了极大的发展,现有也已经开发了很多种方法体系,包括经典LAMP技术和RPA技术。等温扩增有快速灵敏,对仪器要求低,是分子POCT诊断领域重要的技术力量。

第二项技术即是最近发展的CRISPR诊断技术。主流CRISPR诊断技术主要基于CRISPR-Cas12或Cas13来开发,利用了Cas蛋白“反式切割活性”,可以将体系中的单链核酸高效的切割。


所以,CRISPR诊断的原理就是:当待检体系中存在靶标核酸时,Cas蛋白在向导RNA的引导下特异识别靶标序列,形成复合物,进而被激发出针对切割单链核酸的“反式切割活性“,将体系中的荧光标记探针切碎,发出荧光信号,完成检测过程,通过检测体系是否发光来判断靶标核酸是否存在。


将恒温扩增和CRISPR诊断技术结合起来,既可以利用恒温扩增的快,灵敏和简便,又可以利用CRISPR的特异和灵敏,在进行快检的同时,既不用担心检测的假阳性和假阴性问题,也不用担心PCR检测中不确定的“灰区”问题。

对于伯杰利用由其实验室开发的,吐露港公司授权的CRISPR诊断专利技术,成功开发的国内首款CRISPR快检一体机BG-Nova-X8,院士对其速度和通量表示了赞赏,认为仪器可以在30-40分钟内完成24个新冠标本检测,可以期待这个系统能够为新冠快检多做贡献。

赵院士提到,未来技术的展望,等温扩增的特异性和灵敏度都需要进一步提升,可以通过和别的技术结合,“取长补短”来提升检测特异性和灵敏度,这一次伯杰将等温扩增与CRISPR技术的尝试,就是迈出了可喜的一步。


等温扩增的一管多重问题还需要创新的思路或者原理方面的突破,另一方面把恒温扩增,CRISPR诊断技术,和数字PCR技术的绝对定量原理结合起来,来实现绝对定量,在未来有更多发展的可能性。 

04
CRISPR技术的未来研究方向

可以说,CRISPR/Cas系统毫无疑问为感染性疾病的诊断提供了新的方法和契机,总结来说,它具有如下优点:



相较于基于PCR的传统方法,毫不逊色的灵敏度和特异度


检测所需时间短


简单便携,不依赖昂贵的仪器和严苛的实验环境


试剂耐受冷冻干燥,便于储存和携带


标本前处理可以非常简单


结果读取方便,能通过荧光或者肉眼读取结果

这几大优点使得CRISPR检测平台可以对病原体核酸分子实现实时快速检测。根据以上的分析,未来CRISPR技术的两大研究方向也初见雏形:


第一,是新的Cas蛋白的开发及突变体的筛选鉴定。例如后来发现的Cas14蛋白,不同于Cas12和Cas13,其擅长识别单链DNA,丰富了CRISPR工具箱。而具有不同切割特性的Cas蛋白的筛选鉴定为提高检测通量及降低“脱靶效应”提供了方法。


第二,是将CRISPR/Cas其和其他的技术平台结合起来,开发新颖实用的生物传感策略。比如将Cas9蛋白固定于石墨烯场效应晶体管,以及将Cas系统的报告探针固定于电极上,从而实现不需要使用信号扩增的电化学生物传感器的构建。使用水凝胶作为其响应原件实现多样化的信号输出。与微流体技术结合开发出的CARMAN技术,可以对数十个样本,上百种病毒进行快速检测,为解决通量低的问题提供了方法等。


不断地将新兴的材料与技术与CRISPR技术结合实现优势互补,开发出更实用新颖的检测策略用于感染性疾病诊断,将是未来一段时间内的研究重点。


关于伯杰医疗

上海伯杰医疗科技有限公司是一家致力于感染性病原体分子诊断试剂研发和应用,深耕于多重荧光PCR诊断试剂和痕量病毒二代测序试剂及相关服务的国家高新技术企业。公司围绕感染性病原体这一主线,从诊断试剂、诊断仪器、测序服务和医检所服务等多个面提供全套解决方案。公司秉承“勇于创新,质量为先”的方针,为医疗机构、疾控公卫、高校科研等合作伙伴提供优质产品与服务。

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