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集高灵敏度、快速、高特异性于一身的qPCR，是分子诊断学最常用的一种方法；然而，大家常常会被它的异常曲线所困扰。比如，某个通道所有阴性样本的扩增曲线都向下倾（如下图）。今天，伯杰技术就与您分享导致这种“怪异曲线”的原因及解决方案。
原因分析
这种怪异曲线下倾的根本原因是qPCR仪矫正过度导致的，荧光的发射光谱是一个抛物线，常见的荧光物质FAM、 VIC、 ROX的发射光谱之间存在交叉（如下图），qPCR 仪通过计算减去因交叉误读的信号，常见的计算方法是：A 通道计算得到的信号（FA）= A通道检测的信号– B通道检测的信号*K，这个的K是机器预设的固定参数；有时，B通道串到A通道的实际信号的比值要小于固定参数K，设备在计算时就导致了A 通道扩增曲线向下倾斜的情况。
举个例子，在FAM通道检测的信号中，假设机器预设ROX通道串到FAM 通道的K=20%，但是实际上串到FAM 通道的ROX信号只占ROX通道检测信号的10%；而机器在计算时，只会按照预设的固定参数K=20%进行计算，即，FAM通道每次都会多减去10% ROX通道的检测信号。随着扩增ROX通道信号越来越大，FAM通道多减去的信号也越来越大，若此时FAM 通道是阴性样本，就导致扩增曲线倾斜的更严重。
解决方法
2、点击”Plate” → “Advanced Setup”，关闭其他通道，如下图所示：
3、点击”Results”，回到结果分析界面，然后，点击“Analyze”重新分析即可，如下图所示：
看，重新分析后的曲线，是不是清爽许多？回到了原来那熟悉的样子
（本文以ABI Q5仪器为例，其他机型如遇该问题，也可使用该方法调整、分析）