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【干货分享】第四期:PCR结果分析,自动基线也别用啦

基线是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,即所谓的基线(如图1)。

2022-02-21


上期干货分享,淘气的小编留了一手,其实调节阈值线在ABI7500上还有更快捷的方法,只要在曲线图下方把“Auto”取消,再点击勾选Show:Threshold就可以啦!(如下图所示)

细心的你可能发现,除了Threshold(阈值线),还有Auto Baseline(自动基线)。在通常情况下,PCR实验结束,阈值线和基线都是默认为“Auto”的,今天,我们就来聊一聊什么是基线?取消自动基线,如何调节基线范围?以及,基线调节和阈值线调节是怎样配合分析PCR结果的?
 1. 什么是基线? 

基线是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,即所谓的基线(如图1)。
基线范围的设置是同步设置的,即不管一个实验数据里面有多少扩增曲线和通道,以及各曲线指数增长期的起始位置,以ABI7500为例,该仪器一般默认的起始和终止循环数为3~15个循环(如图2)
图 1

图 2



2. 仪器自动基线与手动基线会呈现怎样不同的结果?

情况一:你是否也遇到过这样扩增曲线,如图3所示,器自动基线设置的太宽,就会导致基线下倾的现象。

图 3

导致这种现象的主要原因就是机器自动基线设置的太宽导致的,标本在15个循环之前就进入指数增长期,而机器自动基线固定的把指数增长期作为基线,就导致此种曲线的出现,只需手动把基线起始循环数调整为指数增长期之前即可,比如将此数据的起止循环数调整为3-8个循环数后,扩增曲线就恢复正常了,如图4所示:

图 4


情况二:基线不平,不仅可能存在的弱阳性曲线“被淹没”,还导致阈值线“无从安放”,如图5所示:

图 5

此时,只需手动把基线的起止循环数调整到合适位置即可,比如,把图5的起止循环数改为10-20个循环后,基线就会变平整,阈值线也不再“无从安放”,如图6所示:

图 6


情况三:实验中常见的气泡干扰实验结果分析,如图7所示:

图 7

气泡导致的折线,不仅影响阈值线调节的准确性,更会影响结果的判读。这种情况怎么调整基线呢?很简单,只需把基线的起始循环数设置在气泡出现的循环数后即可。比如,图7中的2个孔位气泡破裂的循环数为11、14,我们将起止循环数设置为15-20后,即可恢复正常,如图8所示:

图 8

此时调节阈值线,会更容易判断阈值线应该处于什么位置(可以参考上一篇干货——调节阈值线),从而得到更准确的Ct值。



3. 如何手动调节基线?

文章开头介绍了在ABI7500上调节手动基线的快捷方法;而根据仪器的区别,调节基线的方式也会有所区别。一般来说,调节基线的位置都会在“Analysis”→ “Analysis Settings”这样的菜单栏选项中,取消所有的“Auto…”,输入合适的基线范围,再“Apply”即可。不知道多少合适?没关系,多调试几个基线的范围就可以调整出既美观又准确的基线了。


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