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上海伯杰登革热快筛+病毒全基因组研究整体解决方案
发布时间:2017-10-10   浏览:82  

上海伯杰登革热快筛+病毒全基因组研究整体解决方案

 

最近朋友圈上“登革热”这三字刷爆了屏,云南、浙江、广东、山东等地陆续出现小规模的登革热疫情,9月26日上海市卫生计生委发布发现首例本地感染登革热病例。防控形势严峻,如何通过实验室手段快速筛查病原体?如何对病原体基因组深度研究为登革热防治策略提供参考?伯杰通过本篇文章详细介绍整体解决方案。

 

登革热概况

登革热是由登革病毒经蚊媒传播引起的急性虫媒传染病,病毒感染后可导致隐性感染、登革热、登革出血热,登革出血热我国少见。典型的登革热临床表现为起病急骤,高热,头痛,肌肉、骨关节剧烈酸痛、部分患者出现皮疹、出血倾向、淋巴结肿大、白细胞计数减少、血小板减少等。由于本病系由伊蚊传播,故流行有一定的季节性,一般在每年的511月份,高峰在79月份。在新流行区,人群普遍易感,但发病以成人为主,在地方性流行区,发病以儿童为主。

 

登革热全球分布情况

登革热在全球范围内广泛传播,主要分布在热带及亚热带地区。该病于1779年在埃及开罗、印度尼西亚雅加达及美国费城发现。1970年之前,只有9个国家经历过严重的登革热流行,但目前非洲、美洲、东地中海、东南亚和西太平洋区域已有128个国家或地区的39亿人口处于登革热风险之中;美洲、东南亚和西太平洋地区受影响最为严重;每年有5亿人感染登革热,2万以上死于登革出血热和登革休克综合征。随着全球气候变暖及旅游事业发展,媒介伊蚊的地理分布范围不断扩大,DENV感染在全世界范围内播散,已成为世界上分布最广、发病人数最多、危害最大的重要传媒病之一。



图1  登革热全球分布地图

 

我国登革热流行情况

我国南方在20世纪20~40年代曾有过登革热流行,但此后登革热在我国销声匿迹数十年,直到1978年又卷土重来,首先在广东省佛山市发生暴发流行。此后,我国南方登革热的疫情不断,自2012年以来,我国连续4年出现较大规模的本地暴发疫情,并于2014年达到峰值。2014年广东省发生了登革热的暴发流行,是近20年来最大的流行,发病人数达到45189人,死亡6人,对人民健康造成了严重威胁。截至今年831日,2017年全国累计报告登革热病例1468例,较去年同期(831例)上升77%,无死亡,病例主要分布在云南、浙江、广东、山东等地。浙江、山东等地出现小规模的爆发,病例数较往年有大幅度上升。

 

2  2016年中国大陆地区登革热病例分布(不含外籍及中国港澳台)

 

3  2013-2017年我国登革热病例数周分布图(截至831日)

 

登革热病毒分子结构

登革病毒的基因组为一单正链RNA分子,长约11kb。其基因组的5′端有I型帽子结构,3′末端为CUOH,没有多聚A结构,但有一个十分保守的核苷酸序列。登革病毒RNA5′端和3′端各有一段非编码区UTR,中间是仅有的一个长的开放读码框架ORF,基因组约96%的核苷酸序列在此框架内。该ORF编码病毒的3种结构蛋白(核心蛋白C、膜结合蛋白前体PrM和包膜蛋白E)和7种非结构蛋白(NS)。

结构蛋白是组成病毒颗粒的主要成分。C蛋白富含碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸残基,其上具有特异的抗原簇,为补体结合性抗原。PrMM蛋白的前体,在病毒颗粒成熟的末期,PrM蛋白经酶裂解成M蛋白,PrMM蛋白均参与病毒表面结构的构建。最主要的结构蛋白是E蛋白,E蛋白执行病毒颗粒一些主要的生物学功能,如细胞趋向、细胞融合以及诱导血凝抑制抗体,中和抗体产生等。E蛋白上,具有中和抗原表位、型特异表位、登革病毒种及黄病毒属特异性表位,在登革病毒的致病和免疫中起着至关重要的作用。非结构蛋白仅存在于病毒感染的宿主细胞中,是登革病毒的酶或调节蛋白等,与病毒的复制、蛋白加工及病毒装配密切相关。第一个非结构蛋白是NS1蛋白,其在病毒生命循环中的功能还不清楚。NS2a是一种蛋白酶,NS2b有协同蛋白酶进行酶解的作用。NS3NS5是具有RNA聚合酶活性的非结构蛋白,NS4aNS4b目前认为可能与RNA聚合酶作用的辅助因子有关。

 

4  登革热病毒分子结构图

 

登革热病毒分子生物学研究意义

登革热病毒分为1-4血清型,不同血清型病毒在氨基酸水平的同源性为60-75%DENV-15个基因型,其中基因Ⅰ型主要在亚洲(中国、日本等)和东南亚国家(越南、老挝、缅甸等)流行;基因Ⅱ型和基因Ⅲ型分别主要在泰国和马来西亚国家流行;基因Ⅳ型主要在澳大利亚,印度尼西亚等国家流行;基因Ⅴ型则主要是在美洲和非洲一些国家流行。DENV-26个基因型,分别是亚洲1型、亚洲2型、美国型、美国/亚洲型、混合型和森林型。DENV-3-Ⅳ型基因型。DENV-4-Ⅲ型基因型和sylvatic型。基因型分布具有地理分布特点,随着国家和洲际间贸易和旅游交流的发展,这种基因型分布也发生变化,出现流行基因型多样化的特点。

不同型别的登革热病毒,其毒力也不同,对疾病严重程度产生的影响也不一样;病毒的位点突变,流行株的更替,有助于病毒更好的适应,增强了病毒感染力。全基因组序列分析,开展分子流行病学调查;分析病毒变化趋势,提高疫情早期预警的能力;对不同亚型的病毒株进行分型有利于深入了解相同血清型中不同地域、不同年份病毒株的遗传差异,对病毒的分子流行监测、毒株地域来源的追踪等也具有重要的意义。

病毒的主要包膜蛋白为E蛋白,全长为494-501个氨基酸,含有特异性抗体结合表位、型特异性表位和属特异性表位。E蛋白位于病毒毒粒表面,构成毒粒的突起,决定着病毒的组织亲嗜性,并介导病毒与细胞受体的结合,是影响病毒毒力、引起保护性免疫应答及免疫病理损伤的重要成分。因此,E基因系统进化树对于分析基因的多样性具有重要意义。

 

登革热快筛+病毒全基因组研究整体解决方案

登革热荧光PCR快筛

登革热病人发病一周内,采集的血清、尿液、唾液、组织等标本可开展核酸检测和病毒分离。一般发病后6天内血液标本病毒核酸检出率高,上海伯杰医疗科技有限公司生产的“登革热病毒系列(通用、I型、II型、III型、Ⅳ型)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)“,1小时10分钟快速完成检测。发病后5天内血液标本病毒分离率较高,将标本接种于蚊源细胞(C6/36)或哺乳动物细胞(BHK21Vero)进行分离培养,出现病变以后,用检测抗原或核酸的方法鉴定病毒。

 

5  登革热首次感染实验室检测指南

登革热病毒一代测序

上海伯杰医疗科技有限公司生产的“登革热病毒1-4型一代全基因测序试剂盒”,针对登革热病毒各型别精心设计了4套测序引物,采用预制96孔板,只需加入核酸就能快速完成各型别的登革热病毒全基因测序。所有引物设计时都已加M13,扩增PCR产物直接送我公司或其他测序公司,采用M13通用引物即可进行测序,非常方便。送我公司测序的我公司免费提供序列拼接。获得序列需要专业分析,伯杰贴心为你提供增值服务,我公司的生物信息专家将量身定制,一对一服务,可进行序列比对BLAST、多重序列比对MSA,开展遗传进化分析(Phylogenetics)、突变分析(Mutation analysis),构建分子进化与系统发生树,并进行评估。

 

6  登革热快筛+病毒全基因组研究整体解决方案

 

登革热病毒全基因组序列二代测序

上海伯杰医疗科技有限公司构建的病毒二代测序平台,样品通过特殊处理、痕量病毒基因文库的构建、深度测序和生物信息学分析等过程,大大提高样品中病毒核酸检测灵敏度和病毒全基因组覆盖率。如近期为一客户进行的登革热病毒二代测序,收集的数据中病毒序列占93.9%,其中黄病毒属全基因组的覆盖率近100%,覆盖的序列数达350000条。

 

7  下机数据的序列组成

 

                     图8  覆盖度最高的前五个病毒

 

  

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